(1) 準(zhǔn)備
無(wú)菌超凈臺(tái),酒精燈,75%酒精噴壺,二氧化碳培養(yǎng)箱,37℃水浴鍋,離心機(jī);培養(yǎng)瓶,含10%胎牛清的*培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及PBS磷酸緩沖液(提前放置超凈臺(tái)使平衡到室溫),無(wú)菌工作服(白大褂),口罩,手套,記號(hào)筆
(2) 步驟
1.穿好無(wú)菌工作服,帶上口罩和手套,快速?gòu)囊旱锶〕鰞龃婀埽焖俜胚M(jìn)37℃水浴鍋緩慢搖晃使細(xì)胞解凍,注意凍存管的封口膜不要破裂,防止污染。
2.解凍后用紙擦干凍存管表面的水滴,酒精噴壺噴灑適量75%酒精消毒凍存管封口處。
3.開(kāi)超凈臺(tái),點(diǎn)燃酒精燈燃燒片刻后(可提前準(zhǔn)備),凍存管放超凈臺(tái),換新手套,小心打開(kāi)凍存管,避免污染,無(wú)菌吸管將1ml細(xì)胞全部吸出至5ml無(wú)菌EP管,補(bǔ)加9ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋,1000rpm,離心5min使細(xì)胞沉淀,棄上清。
4.加入新鮮配制的含10%清的培養(yǎng)基4ml,輕輕混勻,用吸管將細(xì)胞移至25T培養(yǎng)瓶。
5.平躺放置培養(yǎng)瓶,8字形混勻后,置于37℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
6.培養(yǎng)24小時(shí)后,顯微鏡觀察細(xì)胞(貼壁細(xì)胞)貼壁后,小心更換培養(yǎng)基,根據(jù)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行傳代培養(yǎng),培養(yǎng)瓶上標(biāo)記:操作者,時(shí)間,細(xì)胞類型。
7.有的實(shí)驗(yàn)員的培養(yǎng)基會(huì)加入抗生素防止細(xì)胞污染,但是這對(duì)于掌握細(xì)胞培養(yǎng)是非常不利的,不加抗生素培養(yǎng)細(xì)胞更能提醒實(shí)驗(yàn)者無(wú)菌操作的意識(shí)。一旦細(xì)胞出現(xiàn)污染,易于發(fā)現(xiàn),一旦發(fā)現(xiàn)污染的細(xì)胞應(yīng)立刻煮沸丟棄,以免污染同實(shí)驗(yàn)室其他細(xì)胞。
8.細(xì)胞長(zhǎng)滿90%-100%即可傳代,小心打開(kāi)培養(yǎng)瓶,瓶口過(guò)酒精燈消毒,棄培養(yǎng)基。
9.加入1mlPBS,潤(rùn)洗細(xì)胞,重復(fù)3次,棄PBS。
10.加入4ml*培養(yǎng)基,用無(wú)菌吸管小心吹打貼壁細(xì)胞或者用胰蛋白酶消化細(xì)胞使細(xì)胞脫落。
11.轉(zhuǎn)移1/2脫落的細(xì)胞至新的培養(yǎng)瓶,各瓶補(bǔ)加*培養(yǎng)基至4ml。
12.小心封口,平躺放置培養(yǎng)瓶,8字形混勻后,置于37℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
13.待長(zhǎng)滿后,按同樣的方法傳代培養(yǎng)。
二 凍存
當(dāng)不需要使用細(xì)胞或者細(xì)胞量足夠時(shí),可以將細(xì)胞凍存起來(lái),供以后實(shí)驗(yàn)用
(1) 準(zhǔn)備
細(xì)胞凍存液(20%清、10%DMSO、70%基礎(chǔ)培養(yǎng)液),梯度降溫盒
(2) 步驟
1.選取活力好,密度約70%細(xì)胞用于凍存,此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用于凍存。
2 .細(xì)胞吹打或者胰酶消化后,轉(zhuǎn)移至無(wú)菌EP管,1000rpm里面5min。
3.棄上清,加入新鮮配制的細(xì)胞凍存液,25T細(xì)胞可以加入2ml細(xì)胞凍存液,分裝2個(gè)凍存管,細(xì)胞*密度為5*106-1*107個(gè)每ml。
4.做好標(biāo)記,放入梯度降溫盒(提前平衡至室溫)。
5.將梯度降溫盒放入-80℃冰箱過(guò)夜,第二天取出凍存管,快速放入液氮保存。
氧化碳培養(yǎng)箱是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的必要設(shè)備,那么在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)有哪些經(jīng)驗(yàn)是我們可以借鑒的呢?下面讓我們一起來(lái)看一下。
1、啟蒙老師的重要性
一般進(jìn)實(shí)驗(yàn)室都有師兄師姐帶著做,他們就是你做細(xì)胞的啟蒙老師。他們的操作手法、細(xì)節(jié)、理論講解就成了你操作的準(zhǔn)則,如營(yíng)養(yǎng)液、細(xì)胞瓶的擺放位置;滅菌處理程序;開(kāi)蓋手法;細(xì)胞吹打手法等等。要學(xué)會(huì)他們的正確操作,在*次的時(shí)候就要重視。
2、像養(yǎng)孩子一樣養(yǎng)細(xì)胞
細(xì)胞真的很脆弱,每天都去看看它,以防止出現(xiàn)培養(yǎng)箱缺水、缺二氧化碳、停電、溫度不夠等異?,F(xiàn)象,也好及時(shí)解決這些意外,避免重復(fù)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的更大痛苦。
3、好細(xì)胞要及時(shí)保種
細(xì)胞要分批傳代,這樣即使有一批出了問(wèn)題,還有一批備用的。像后者一般人可能不容易做到。有一次細(xì)胞污染了,全軍覆沒(méi)。當(dāng)時(shí)可后悔沒(méi)有保種。
4、每種細(xì)胞都有自己的特性,要區(qū)別對(duì)待。
細(xì)胞跟人一樣,不同的細(xì)胞,培養(yǎng)特性是不一樣的。培養(yǎng)過(guò)程中要細(xì)細(xì)體會(huì)。不同細(xì)胞株使用不同的培養(yǎng)基和清。
如平滑肌細(xì)胞很活躍,喜歡熱鬧,2~3 天就好多人口,而且不太愛(ài)吃喝,真是養(yǎng)的孩子了。內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞性格相近,不過(guò)它很不講,也很邋遢,里面有很多分泌屋,要經(jīng)常換洗才行。RAW264.7 細(xì)胞也很開(kāi)朗,而且很能吃,要經(jīng)常喂它,頭疼的是細(xì)胞很容易活化,培養(yǎng)它的瓶子和環(huán)境沒(méi)有內(nèi)毒素才好。
5、培養(yǎng)前的工作準(zhǔn)備充分
包括耗材的處理、試劑的配置,無(wú)菌檢驗(yàn)等等。
玻璃器皿的清洗。對(duì)于玻璃器皿(細(xì)胞瓶、裝營(yíng)養(yǎng)液的瓶子、小青霉素瓶等)要先用洗衣粉刷干凈(注意死角),然后沖干凈。用酸液浸泡 24 h 以上,之后用清水沖洗 10 遍,除去殘留酸液。瓶子之類,沖洗過(guò)程要使勁搖晃。然后在雙蒸水浸泡 24 h。晾干后包扎,160℃ 干烤 2 h 待用。
試劑配置。細(xì)胞培養(yǎng)用的液體一般使用雙蒸以上的水即可。并注意 pH 值的調(diào)節(jié)。
無(wú)菌檢驗(yàn)。主要采用過(guò)濾除菌:如胰酶、抗生素、G-418 溶液、各類培養(yǎng)基、丙酮酸鈉、谷氨酰胺等。有些可以采用高壓滅菌:如 PBS、D-Hank's等。
6、試劑分裝保存
包括營(yíng)養(yǎng)液、胰酶、清等。
清特別重要。清必須貯存于 –20℃,如果一次無(wú)法用完一瓶,可將 40~50ml 分裝于無(wú)菌酸處理瓶中,甚至置青霉素瓶保存。一般廠商提供的清為無(wú)菌,不需再無(wú)菌過(guò)濾。若發(fā)現(xiàn)清有許多懸浮物,則可將清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾,勿直接過(guò)濾清。(一般情況下不影響細(xì)胞培養(yǎng))
瓶裝清一定要逐步解凍: 4℃ 冰箱全溶后再分裝,在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度與成分均一,減少沉淀的發(fā)生。勿直接由 –20℃ 直接至 37℃ 解凍,因溫度改變太大,容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。
熱滅活是指 56℃,30 分鐘加熱已*解凍之清。水浴鍋升到 56℃后,將清放入,待溫度升高到 56℃ 后計(jì)時(shí),一般 5 分鐘左右規(guī)則搖晃均勻一次。此熱處理之目的是使清中之補(bǔ)體成份去活化。除非必須,一般不要作此熱處理,因?yàn)闀?huì)造成沉淀物之顯著增多,且會(huì)影響清之品質(zhì)。注意更換新清(包括不同批次)對(duì)細(xì)胞的影響。
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